https://orcid.org/0000-0002-5408-6263
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La microbiología ha sido durante muchos años una disciplina muy manual, basada en cultivos, realización de pruebas bioquímicas o en la observación de características físicas y de tinción. El diagnóstico de las enfermedades infecciosas ha ido cambiando de forma muy notable en los últimos años debido a los avances en técnicas de diagnóstico, basados en la biología molecular. Estas técnicas permiten establecer el diagnóstico de forma mucho más precoz y fiable, a la vez que permiten la monitorización de la enfermedad, establecer su pronóstico y aumentar la supervivencia. Entre las técnicas de biología molecular, existen muchas variantes para amplificar, detectar y secuenciar los ácidos nucleicos (ADN o ARN en función de la sospecha clínica). La técnica más básica es la reacción en cadena de la polimerasa y sobre esta se han ido desarrollando diferentes modificaciones para mejorar el proceso de diagnóstico e interpretación, entre ellas, la PCR en tiempo real o cuantitativa, la RT-PCR, los microarrays y la secuenciación. A lo largo del trabajo, se detallan diferentes técnicas que permiten el análisis de diferentes muestras para uno o múltiples microorganismos (mediante la utilización de paneles).
Palabras clave:
Diagnóstico, biología molecular, microorganismo, identificación.
Microbiology has been for many years a very manual discipline, based on cultures, performing biochemical tests, or observing physical and staining characteristics. The diagnosis of infectious diseases has changed dramatically in recent years due to advances in diagnostic techniques based on molecular biology. These techniques make it possible to establish the early and reliable diagnosis, while allowing the monitoring of the disease, establishing its prognosis and increasing survival. Among molecular biology techniques, there are many variants to amplify, detect and sequence nucleic acids (DNA or RNA based on clinical suspicion). The basic technique is the polymerase chain reaction and different modifications have been developed on this to improve the diagnostic and interpretation process, including real-time PCR or quantitative PCR, RT-PCR, microarrays and sequencing. Different techniques that allow the analysis of different samples for one or multiple microorganisms (through the use of panels) are detailed in this work.
Keywords:
Diagnosis, molecular biology, microorganism, identification.
Tradicionalmente la microbiología ha sido una disciplina muy manual. Algunas de las razones son la gran diversidad de tipos de muestras que se reciben en el laboratorio de microbiología, el número de microorganismos existentes y el volumen de muestras (mucho menor que un examen bioquímico o hematológico).
Con los grandes avances en los últimos años la microbiología clínica ha cambiado rápidamente. La identificación de microorganismos hasta hace relativamente poco tiempo dependía de un cultivo, la realización de pruebas bioquímicas y la observación de características físicas (morfología de las colonias) y de tinción (tinción de Gram, Ziehl-Neelsen, tinta china…). Posteriormente surgió la espectrometría de masas y esta se aplicó a la identificación de microorganismos (MALDI-TOF). Esta tecnología permite la identificación de bacterias y hongos en minutos, es económica y fiable en la mayoría de los microorganismos (1).
La bacteriemia se define como la presencia de bacterias en sangre, y se confirma tras el hallazgo de estas en los hemocultivos. Según las características clínicas del paciente, se puede establecer un origen de la infección que haya provocado la diseminación de las bacterias a la sangre. La fungemia se utiliza para designar la presencia de hongos en la sangre, uno de los más frecuentes son las levaduras del género Candida spp., cuya aparición es muy frecuente a partir de infecciones de catéteres. Por otro lado, la viremia se define como la presencia de virus en la sangre (2).
La microbiología clínica es una ciencia basada en la identificación del agente etiológico de una infección y el establecimiento de un tratamiento correcto contra el o los agentes patógenos. Es importante la relación entre el clínico y el laboratorio, por un lado el clínico debe confiar en los resultados obtenidos en el laboratorio y el laboratorio debe garantizar la entrega de resultados exactos y clínicamente importantes lo antes posible.
La identificación precoz de los microorganismos causantes disminuye de forma importante la mortalidad asociada a estos procesos, que puede variar entre un 10% y un 30% según el tipo de paciente, el origen de la infección, el manejo del paciente durante la infección y la rapidez de la identificación e instauración de un tratamiento. La instauración del tratamiento correcto es difícil y dependerá de los síntomas clínicos del paciente y la epidemiología local para conocer posibles resistencias a antibióticos (microorganismos multirresistentes) (2).
El diagnóstico es una etapa crítica en el manejo de los pacientes. La dificultad de detectar muchos patógenos mediante la microbiología clásica ha hecho que se desarrollen nuevos métodos diagnósticos. La microbiología clásica está asociada a inconvenientes como largos periodos de crecimiento, condiciones muy especiales de cultivo, muestras mal recogidas que complican la interpretación de los resultados o incluso imposibilitan la obtención de un resultado (3). Todo esto, ha dado paso a nuevos métodos de diagnóstico, entre ellos los basados en biología molecular, que han avanzado mucho en la última década, dando lugar a técnicas muy sensibles y específicas, capaces de detectar y cuantificar pequeñas cantidades de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) y proteínas de microorganismos que pueden aislarse de un cultivo o no ser cultivables in vitro.
El laboratorio de biología molecular es el área diagnóstica de mayor dinamismo y crecimiento en los laboratorios clínicos. Estas técnicas así como la automatización, la nanotecnología y la informática han permitido mejorar el diagnóstico de enfermedades infecciosas y con ello, la instauración temprana de un tratamiento que permita disminuir la morbimortalidad asociada a estas infecciones. Además, han permitido mejoras en la prevención de estas infecciones, por lo que las ventajas son muy importantes (4).
Una prueba diagnóstica ideal debería ser capaz de procesar un pequeño volumen de muestra, ser rápida, técnicamente simple o automatizada, de bajo costo y que no requiriese procesamiento por lotes, es decir, que no sea necesario esperar a reunir varias muestras para su procesamiento. Esto último provocaría retrasos en la entrega de resultados (5).
El aumento de la tasa de infecciones graves causadas por bacterias resistentes a antibióticos ha sido otra de las causas por las que se han intentado encontrar nuevas tecnologías que permitan establecer de forma más rápida los tratamientos y disminuir los errores asociados a tratamientos empíricos (5). Los avances en estas técnicas también han hecho que aumenten los conocimientos sobre la resistencia bacteriana a antibióticos.
Por otro lado, la biología molecular ha permitido tipificar, entendiendo por esto el identificar y caracterizar microorganismos patógenos causantes de brotes infecciosos, la fuente de infección y el patrón de diseminación. La secuenciación de genomas completos de bacterias, virus o patógenos fúngicos se está empleando para la detección de patógenos concretos en brotes epidemiológicos (4).
En cuanto a estas técnicas, existen muchas variantes para amplificar, detectar y secuenciar los ácidos nucleicos. La técnica más utilizada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica posteriormente se acompaña de la detección de la amplificación mediante gel de agarosa con un intercalante inespecífico fluorescente.
La secuenciación de los productos amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite identificar bacterias y otros microorganismos comparándolos con secuencias ya conocidas y que están incluidas en múltiples bases de datos. La secuenciación de ARN ribosomal 16S permite detectar e identificar microorganismos no cultivables o que presentan complicaciones en su crecimiento o cultivo. El ARN ribosomal 16S es muy específico de cada bacteria y esto hace que sea una buena diana para la identificación del microorganismo (6).
La introducción en la práctica diaria de nuevas tecnologías tiene ventajas entre las que destacan mejores cifras de sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos, mayor rapidez en la obtención de resultados, mayor automatización y por tanto, capacidad para asumir una mayor carga de trabajo y mejor gestión de la actividad en el laboratorio. En cuanto a las desventajas asociadas, los analizadores e instrumentos necesarios para esta nueva forma de trabajo son equipos muy costosos, que supondrán una gran inversión inicial para el laboratorio (muchos de ellos no se lo podrán permitir). A pesar de todo, se han realizado diversos análisis de costo-efectividad que hacen que esta desventaja sea mínima comparada con las ventajas asociadas a esta tecnología (4).
A la hora de la realización de las técnicas pueden tener diferentes enfoques, pueden ir dirigidas a un único agente patógeno o pueden ir orientadas a varios patógenos a la vez, o incluso a la identificación de posibles patógenos causantes de una patología concreta. Por ejemplo, podemos encontrar sistemas orientados únicamente a la detección de Clostridium difficile o paneles de patógenos bacterianos, parásitos o virus causantes de patología gastrointestinal o respiratoria, entre otras (4). Hay que tener en cuenta cuando se trabaja con paneles de microorganismos, que aunque el resultado sea negativo no se puede excluir la infección, por lo que los estudios de identificación deben continuar.
La utilización de paneles para la identificación del microorganismo causante presenta diferentes ventajas e inconvenientes. Por un lado, destaca la rapidez con la que se obtienen los resultados (y la precoz instauración del tratamiento), la realización de estudios epidemiológicos y la identificación de brotes. Pero por el otro, destaca el alto coste asociado a la realización de estas pruebas, la realización de un panel dirigido a población general y no individualizado, la posible detección de portadores y no pacientes enfermos, posibilidad de obtención resultados falsos positivos y la necesidad en muchos casos de realizar pruebas tradicionales de forma paralela (7).
Las técnicas de biología molecular sirven para analizar ácidos nucleicos y para detectar, e identificar tanto microorganismos, como diferentes genotipos dentro de una misma especie y genes de resistencia al tratamiento farmacológico. Todas estas técnicas necesitan un paso previo de extracción de ADN o ARN. Una vez extraído debe purificarse de forma adecuada para evitar la presencia en la muestra de inhibidores o sustancias que contaminen y que impidan la correcta realización de la técnica posterior.
La extracción del ADN es el paso más crucial en todo el proceso relacionado con la biología molecular. Se suelen utilizar kits comercializados que incluyen el protocolo específico para la extracción(8). Los métodos de extracción de ADN se caracterizan por la lisis de la célula, la inactivación de las enzimas nucleasas celulares y la separación de los ácidos nucleicos de los demás restos celulares. Pueden ser de diferentes tipos: rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica), por tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles) o por digestión enzimática (proteinasa K) (9).
Con los avances en la biología molecular se han desarrollado múltiples equipos que realizan la extracción de ADN de la muestra de forma totalmente automatizada en un corto periodo de tiempo, lo cual supone una gran ventaja en este primer paso del proceso.
Las técnicas de biología molecular se deben realizar en muestras de ADN totalmente puros, para obtener resultados correctos, evitando tanto falsos positivos como negativos. Los métodos de purificación del ADN pueden basarse en diferentes acciones: extracción/precipitación, ultrafiltración, cromatografía, centrifugación y separación por afinidad. El uso de un tipo u otro dependerá de la muestra obtenida, la cantidad de esta, el tipo de ácido nucleico y la técnica posterior con la que se va a trabajar (9).
La técnica de la PCR consiste en la amplificación de una región específica de ADN utilizando unos primers o cebadores (secuencias de ADN que delimitan la zona de amplificación, que tienen una longitud de 15-30 nucleótidos y son complementarios a la región del ADN que se quiere amplificar). Se basa en la acción de diferentes enzimas, entre ellas la ADN polimerasa, que incorpora los nucleótidos en la síntesis de nuevas cadenas de ADN (amplificación).
En esta técnica se reproduce lo que tiene lugar en el interior de la célula. La muestra de ADN se añade en un tubo eppendorf junto con los primers, los desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), una ADN polimerasa termoestable y un cofactor de esta enzima (normalmente magnesio). Una vez introducidos todos los reactivos necesarios para el desarrollo de la técnica, se someterán a una serie de ciclos (25-40 ciclos), con cambios de temperatura característicos y que permitirán amplificar la región concreta del ADN de la muestra.
Figura 1: Productos necesarios para la realización de la PCR.
Figura 2: Termociclador, equipo necesario para la realización de la amplificación.
Cada uno de estos ciclos que forman parte de la técnica de amplificación consta de tres fases, con sus respectivos cambios de temperatura:
Figura 3: Fase de desnaturalización: separación de ambas hebras de ADN.
Figura 4: Fase de apareamiento o annealing.
Figura 5: Fase de elongación.
Cada copia generada en un ciclo sirve de molde para los siguientes ciclos, por lo que la amplificación es exponencial, y el resultado es la obtención de millones de copias de un fragmento concreto.
Figura 6: Amplificación del fragmento diana del ADN de forma exponencial.
Se trata de una técnica muy específica debido a que los primers son específicos de una región concreta. Estos son complementarios a la región del ADN que nos interesa (región diana). Además de ser muy específica, presenta una alta sensibilidad, ya que la cantidad de ADN requerida para que se inicie la amplificación es muy baja. Esta técnica también presenta desventajas, es una técnica lenta y su realización requiere de un gran número de pasos, cada uno con riesgo de contaminación.
La PCR convencional se ha utilizado para la detección e identificación de patógenos presentes en alimentos (por ejemplo Arcobacter spp en carne aviar), para la identificación de los genes asociados a la virulencia de las diferentes especies y para identificar E. coli enterotoxigénica amplificando las enterotoxinas (LT y ST), entre otras aplicaciones (11).
Una vez amplificados los fragmentos de interés, estos se someten a un proceso de migración por polaridad a través de un gel de agarosa, influido por dos campos eléctricos. Los ácidos nucleicos poseen carga negativa (aportada por el grupo fosfato), por lo que al realizar la electroforesis van a migrar en dirección al polo positivo. Tiene una gran capacidad de separación de diferentes fragmentos (de 50Kb hasta 2Mb). Esta técnica complementaria a la PCR se utiliza en la detección de patógenos y genes de resistencia a antibióticos (11).
Dentro de la PCR podemos encontrar diferentes variantes, teniendo cada una de ellas diferentes características y aplicaciones que favorecen los diferentes diagnósticos. Todas ellas han permitido establecer avances en la tipificación, pudiendo determinar la relación clonal entre diferentes infecciones gracias a la amplificación de genes o secuencias de ADN polimórficas (12).
Esta variante de la PCR añade marcadores fluorescentes con el objetivo de saber la cantidad de ADN inicial en todo momento y detectar la presencia de variaciones genéticas. La emisión de fluorescencia será proporcional al número de moléculas producidas, haciendo que la técnica sea cuantitativa.
Para la realización de esta técnica, además de los reactivos necesarios para la PCR convencional, se necesitan sondas marcadas con enzimas, sustratos antigénicos, radioisótopos, quimioluminiscencia o fluorescencia, con capacidad de unión a la cadena de ácido nucleico que se requiere amplificar. En función del marcado de la sonda, para su interpretación se utilizarán diferentes métodos. Se puede utilizar para la identificación de virus, bacterias y hongos. El fluoróforo marcador más utilizado es el SYBR Green, presenta carga positiva y no emite fluorescencia si está libre pero sí lo hace al unirse al surco menor del ADN (9). Se utilizan además, sondas de hidrólisis (TaqMan) (11).
La velocidad de obtención de resultados y la sensibilidad en la PCR en tiempo real en el diagnóstico de enfermedades infecciosas son mayores que en la PCR convencional (13). Otra ventaja de esta técnica es que en la mayoría de los casos, no es necesario el paso posterior de evaluación de los productos obtenidos de la PCR mediante el gel de agarosa o poliacrilamida, pues según se está realizando la técnica ya se sabe si el funcionamiento y la obtención de amplificaciones ha sido correcta.
Se pueden utilizar diferentes sondas fluorescentes para marcar genes de varios microorganismos distintos, de forma que se convierte en una PCR en tiempo real múltiple. En este sentido, la qPCR múltiple se puede utilizar para detectar, identificar y cuantificar entre otros, la presencia de patógenos en alimentos (Campylobacter spp, Salmonella spp). Se considera una buena elección en el análisis de calidad de los alimentos (11).
Tabla 1: Comparación PCR convencional y PCR en tiempo real.
Existen diferentes sistemas comerciales que se basan en la PCR en tiempo real y que se resumen a continuación:
Este sistema consta de unos capilares sobre los que se situará la muestra de ADN junto con el resto de los reactivos necesarios para la realización de la PCR y un equipo que registra la emisión de fluorescencia en tiempo real. Se identifican aquí las curvas de fusión o de melting que permiten la cuantificación. Se caracteriza por ser un sistema muy rápido. A medida que se van amplificando las copias de ADN se va monitorizando el producto gracias a las sondas marcadas por fluorescencia (9). Este sistema permite realizar PCR múltiples y cuantificar ARN, para ello, es necesario llevar a cabo previamente la conversión de ARN en ADNc. Entre los microorganismos que se pueden identificar con esta plataforma están:
Figura 7: En la imagen A se representan las curvas de melting de dos genes presentes en Acinetobacter baumanii (muestras control). En la imagen B se representan las dos muestras control y 3 muestras de pacientes para valorar la presencia o no de los genes en estudio. Tres de las muestras resultan ser positivas para VIM e IMP, mientras que una de ellas es positiva solo para VIM.
Este sistema se basa en la utilización de la sonda TaqMan, la cual posee un fluoróforo en el extremo terminal 5’ y un aceptor de energía (quencher), de tal forma que la energía se transfiere desde el fluoróforo hasta el aceptor. Una vez que la sonda TaqMan se une a la cadena de ADN complementaria tiene lugar la liberación de esta energía desde el fluoróforo y esta será medida en fotodetectores presentes en el equipo Cobas 48 2.0.
Mediante esta plataforma se pueden detectar microorganismos como: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1, utilizado en el seguimiento y la monitorización de la carga viral) y virus de las hepatitis B y C y sus cargas virales.
Esta tecnología utiliza cartuchos de un único uso, específico para cada PCR. En el interior del cartucho se encuentran los reactivos de PCR liofilizados, y en el momento del uso se añaden otros reactivos que acompañan el pack. Es un método muy poco laborioso y sencillo, y se puede utilizar para la identificación de: Streptococcus del grupo B, enterovirus del líquido cefalorraquídeo, Staphylococcus aureus y Mycobacterium tuberculosis. Además, este equipo permite detectar genes que aportan resistencia a la rifampicina en Mycobacterium tuberculosis y a la meticilina en Staphylococcus aureus. En el primer caso, detecta genes que presentan una mutación que hace que se genere una proteína que impide la acción inhibitoria de la rifampicina y en el segundo caso, se amplifica el gen MecA, que es el responsable del 97% de los casos de resistencia a la meticilina.
Se puede realizar el análisis de: VIH-1, VHC, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, virus del papiloma humano, virus de Epstein Barr, virus varicela zoster, parvovirus B19, Mycobacterium tuberculosis, virus del herpes simple I y II y carga viral de Citomegalovirus. Este sistema permite realizar el proceso completo, desde la extracción automatizada de la muestra hasta la interpretación de los resultados posterior a la amplificación y detección de la información mediante PCR en tiempo real (15).
Tagging Oligonucleotid Cleavage and Extension es una tecnología basada en el diseño de oligonucleótidos para detectar ADN. Se basa en la realización de un PCR múltiple. Al igual que las comentadas anteriormente, se utilizan unas sondas específicas marcadas con fluorescencia que producirán señal en el momento en el que se haya producido la extensión del ADN objetivo. Mediante esta tecnología se pueden utilizar diferentes paneles, para detectar patologías respiratorias, meningitis, infecciones de transmisión sexual y patologías a nivel digestivo (16). En el caso de las patologías respiratorias, pueden detectarse las producidas por virus (virus de la gripe, adenovirus, parainfluenza, rinovirus, virus respiratorio sincitial, metapneumovirus, coronavirus, bocavirus y enterovirus), por bacterias (Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis) o por micobacterias (M. tuberculosis, y micobacterias no tuberculosas) (17). En el diagnóstico de estas patologías respiratorias, se pueden usar muestras como esputo, cultivo, tejido fresco o lavados bronco-alveolares.
Se trata de un sistema que puede ser utilizado para la identificación de patógenos infecciosos y genes que producen resistencia a tratamientos farmacológicos presentes en dichos agentes patógenos. Uno de sus usos es la determinación de M. tuberculosis y sus genes de resistencia y la detección de la presencia de Helicobacter pylori y su resistencia a antibióticos (18).
Este sistema combina los procesos de preparación de la muestra, la amplificación y detección y el posterior análisis de los resultados. Trabaja mediante paneles, en función de la clínica que presente el paciente (panel de meningitis, de infecciones respiratorias, de digestivas y el panel sanguíneo). Permite obtener resultados preliminares en una hora.
Figura 8: Pasos para la realización del Film Array. 1º: insertar el cartucho en la estación inicial. 2º: Añadir la solución hidratante. 3º: Insertar la muestra. 4º Insertar el cartucho enel FilmArray y empezar el programa.
Este sistema consta de diferentes etapas, entre las que se incluye el proceso de extracción del ADN, la purificación de este y el proceso de amplificación y de detección de resultados. Procesa múltiples muestras a la vez y ofrece resultados en pocas horas. Trabaja también mediante paneles para detectar tanto microorganismos como genes de resistencia en estos microorganismos.
Figura 9: Procesamiento de la muestra, purificación del ácido nucleico, proceso PCR, amplificación y detección de resultados.
Permite el análisis de ARN y ADN para identificar diferentes microorganismos (VIH, VHB, VHC, Citomegalovirus, virus Epstein Barr, virus BK, virus varicela zoster, virus del herpes simple (1 y 2), adenovirus, parvovirus B19, C. trachomatis y N. gonorrhoeae).
Es una variante de la PCR convencional en la que la hebra molde que se utiliza es ácido ribonucleico (ARN). A partir de esta hebra de ARN se sintetiza ADN complementario (cDNA) sobre el que posteriormente se realizará la PCR convencional. Se trata pues, de un método dividido en dos procesos, el primero de ellos, la transcripción inversa y el segundo, la PCR.
Figura 10: Esquema de los procesos que tienen lugar en la RT-PCR.
Sobre esta prueba además existen diferentes variantes:
La PCR digital (dPCR) se trata de una técnica ultrasensible, por lo que en el diagnóstico de enfermedades infecciosas puede detectar la presencia de microorganismos en concentraciones muy bajas, incluso aquellas que están por debajo del límite de detección de la qPCR. La dPCR proporciona una cuantificación precisa y absoluta de los ácidos nucleicos sin una curva estándar y sin dependencia de la eficiencia de amplificación.
La PCR digital funciona dividiendo una muestra de ADN o ADNc en muchas reacciones de PCR paralelas individuales, depositadas en múltiples pocillos. Aquellos pocillos en los que se amplifique la región diana concreta producirán señal mediante un color, mientras que las negativas no (se utilizan sondas marcadas).
