https://orcid.org/0000-0002-5408-6263
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La anemia se considera la causa más común de consulta médica y la enfermedad hematológica de mayor prevalencia en la población mundial. Por ello es importante realizar un primer diagnóstico diferencial en el paciente con anemia, para facilitar el abordaje de la patología.
Se define como el descenso en la masa eritrocitaria y/o de concentración hemoglobina. Tiene una etiología muy variada y para su diagnóstico es necesario la combinación de varias pruebas hematológicas, una buena anamnesis y en algunos casos estudios genéticos a nivel familiar. Una prueba fundamental para detectar los primeros indicios de anemia es el hemograma, incluido en las analíticas de rutina que se realizan de forma general en las revisiones médicas. Otro punto importante para su detección temprana es la aparición de síntomas, debido a los mecanismos compensatorios del cuerpo ante la hipoxia tisular. Una vez detectada se procede a un estudio más exhaustivo y diferencial, para determinar la causa.
Debido a la importancia de esta enfermedad a nivel global, es esencial la estandarización de valores críticos diferenciados por edad, raza y sexo. Actualización y automatización de las técnicas utilizadas para proporcionar un diagnóstico rápido y facilitar la instauración de un tratamiento o procedimiento con el objetivo de mejorar la vida de los pacientes que la padecen.
Palabras clave: anemia, diagnóstico, fisiología eritrocitaria, hemoglobina.
Anemia is considered the most common cause of medical consultation and hematological disease of higher prevalence in the world population. It is therefore important to make a first differential diagnosis in the patient with anemia, to facilitate the approach of the pathology.
It is defined as the decrease in erythrocyte mass and/or hemoglobin concentration. It has a very varied etiology and for its diagnosis it is necessary the combination of several hematological tests, a good anamnesis and in some cases genetic studies at the family level. A key test to detect the first signs of anemia is the blood count, included in routine tests that are generally performed at medical checkups. Another important point for its early detection is the appearance of symptoms, due to the compensatory mechanisms of the body before tissue hypoxia. Once detected, a more comprehensive and differential study is carried out to determine the cause.
Due to the importance of this disease globally, the standardization of critical values differentiated by age, race and sex is essential. Updating and automation of the techniques used to provide a rapid diagnosis and facilitate the establishment of a treatment or procedure with the aim of improving the life of patients suffering from it.
Keywords: anemia, diagnosis, erythrocyte physiology, hemoglobin.
La hematopoyesis es el proceso de formación de las distintas células sanguíneas: glóbulos rojos, leucocitos y plaquetas. La síntesis de estas células tiene un origen común en las células madre hematopoyéticas o stem cells, con capacidad de diferenciarse a las distintas líneas celulares presentes en la sangre. Este proceso, en las primeras etapas fetales, se produce en el saco vitelino, el hígado y el bazo. Cuando acaba esta etapa, pasan a ser producidas principalmente por la médula ósea.
La médula ósea es un tejido esponjoso que en neonatos está presente prácticamente en todos los huesos y en la edad adulta se localiza, principalmente, en la pelvis, las vértebras, costillas, esternón, sacro y parte proximal del fémur.
Existen dos tipos de médula ósea, la roja y la amarilla. La zona roja es la parte donde se producen las células precursoras de ambas líneas celulares, la línea mieloide y la linfoide, procedentes de una célula madre multipotente común. En una muestra, cuando se visualiza esta parte, se pueden observar tanto a las células progenitoras como a sus derivados en las distintas fases de su desarrollo. Desde la etapa fetal hasta los 5 años de vida la médula roja es predominante en todos los huesos, pero a medida que aumenta la edad y la demanda cambia, comienza a aparecer una zona donde se encuentran las precursoras de forma inactivada y una mayor cantidad de adipocitos. Esta zona nueva que cada vez aumenta más su extensión en los huesos se denomina la médula amarilla y su función principal es de reserva energética y almacén de nutrientes. Es una parte fundamental para el microambiente o nicho medular (1).
Este proceso de hematopoyesis es continuo, la vida de las células sanguíneas es limitada y necesitan una reposición sin interrupción para asegurar el equilibrio entre la demanda, la destrucción y las que se forman de novo. Los eritrocitos tienen una media de 120 días, siendo las más longevas, pero las plaquetas sólo tienen poco más de una semana y la mayoría de leucocitos de 24-48h, exceptuando linfocitos que pueden sobrevivir meses o años.
La diferenciación de las distintas líneas celulares está condicionada por el microambiente donde se dan una serie de reacciones y señales citoquímicas que producen la maduración y expansión siguiendo una línea concreta. Los progenitores linfoides darán lugar a los distintos tipos de linfocitos y células dendríticas que acabarán migrando al tejido linfático, mientras que el mieloide producirá la serie granulocítica, eritroide y megacariocítica que pasarán a sangre periférica. Este proceso se define por dos fases: la fase de proliferación y diferenciación, y la fase de proliferación y maduración (2).
La célula multipotente o pluripotente se caracteriza por expresar el antígeno CD34+ en su membrana y por su capacidad de autorrenovación y producción de colonias cuando se cultiva ‘’in vitro’’. Es el origen de todas las células hematológicas y se define como la unidad formadora de colonias linfoides y mieloides (UFC-LM).
Posteriormente, tras la interacción con determinados factores estimulantes de colonias, de crecimiento e interleucinas que favorecen la expresión génica hacia una línea en concreto, se determina a qué tipo de progenitor se diferencia: 1) Células progenitoras de unidades formadoras de colonias granulocíticas, eritroides, monocíticas y megacariocíticas (UFC-GEMM); 2) Células progenitoras de unidades formadoras de colonias linfoides (UFC-L).
Una vez se define la línea a celular a seguir, se subdividen en diferentes células progenitoras comprometidas en su diferenciación: Unidad formadora de brotes eritroide (UFB-E), granulomonocítica (UFB-GM) y megacariocítica (UFC-Meg). En el caso de la línea linfoide se pasan directamente a la fase de proliferación y maduración, donde aparecen las células Pro-B y Pro-T, tanto en la médula como en el timo.
Figura 1. Esquema hematopoyesis (3).
En esta fase ya se aprecian las diferencias morfológicas entre unas células y otras, tanto en tamaño y contenido, como en receptores que expresan en su membrana.
La diferenciación dependerá de los factores, hormonas y elementos presentes en el nicho medular (Tabla 1). Los factores estimuladores se encargan de inducir la proliferación de una línea en concreto o de manera inespecífica. Los potenciadores, que normalmente son las citoquinas, tienen efecto sinérgico positivo con los estimuladores, aumentando o favoreciendo su efecto. Los inhibidores, en cambio, impiden el proceso o lo enlentecen.
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FACTORES ESTIMULADORES |
FACTORES INHIBIDORES |
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Fase de proliferación y diferenciación:
Fase de maduración:
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Tabla 1. Factores que intervienen en la hematopoyesis (Elaboración propia).
Cabe destacar, que a medida que van madurando las distintas células, va desapareciendo el nucléolo, el núcleo va disminuyendo su tamaño y en algunos casos desaparece por completo como ocurre en los eritrocitos. Como consecuencia, el espacio citoplasmático va aumentando. El resultado de estas transformaciones en la célula es la pérdida en su capacidad de división, pero una vez maduras ya son funcionales. Estas células en sus últimas etapas de maduración están presentes en la médula y en su lugar de actuación, la sangre periférica o el timo como ocurre con los linfocitos. Por lo que en un frotis de sangre se podrán observar estos elementos formes en sus distintas fases de maduración, aunque en pacientes sanos predominarán las células maduras. Algunas de ellas, como los mastocitos, macrófagos, plasmocitos y células dendríticas, migran a sus tejidos correspondientes (4).
Una vez se produce la diferenciación a la línea eritroide con la aparición de UFB-E, pasa a ser el precursor de hematíes como Unidad formadora de colonias eritroides (UFC-E) y se inicia la fase de proliferación y maduración.
La eritropoyesis completa dura aproximadamente 7-8 días. Gran parte del tiempo del proceso es en la médula ósea y cuando se encuentra en su última fase de maduración en sangre periférica. Hay situaciones en las que la formación de hematíes dura menos tiempo, por ejemplo, cuando aumenta la demanda por lo que se pueden observar mayor número de células inmaduras en sangre periférica. A medida que transcurren las etapas de esta fase de proliferación y maduración hasta obtener el eritrocito funcional, destaca la disminución paulatina del tamaño de la célula, pérdida de la basofilia citoplasmática, aumento de la hemoglobina intracelular y la condensación de la cromatina nuclear. En la última etapa, el núcleo sale por extrusión (5).
Figura 2. Esquema eritropoyesis (3).
Esta célula aparece por diferenciación de la UFC-E y ya se puede identificar al microscopio como célula de la línea eritrocítica. Tiene un tamaño grande de 20-25 µm, forma redonda y a veces ovalada Destaca su citoplasma altamente basófilo y un núcleo grande redondeado con cromatina laxa.
Resultado de la división y maduración del proeritroblasto. En esta etapa observamos una célula más pequeña de 16-18 µm, con una cromatina nuclear más condensada adquiriendo una forma radial, pero sigue manteniendo un citoplasma basófilo. En esta etapa comienza la síntesis de hemoglobina.
Tras la maduración y división del eritoblasto basófilo aparece este eritoblasto que será el primero en perder la capacidad de división celular. Su tamaño es de 8-12 µm, forma y núcleo redondeado, presenta una cromatina madura y condensada. Contiene grandes cantidades de hemoglobina.
El eritoblasto ortocromático aparece tras la maduración del policromático. Tiene un tamaño muy parecido a la fase madura, 7-10 µm de diámetro y presenta un núcleo redondeado con cromatina muy condensada de color oscuro (picnosis). Será la última célula en el proceso de eritropoyesis en presentar núcleo. Gracias a la tinción de Perls se pueden identificar cúmulos de hemosiderina en algunos eritroblastos que pasarán a llamarse sideroblastos. Se encuentran en médula ósea y en pocas ocasiones en sangre periférica.
En la maduración hacia reticulocito se pierde el núcleo por extrusión. Tiene el tamaño de eritrocito maduro 8 µm, presenta un citoplasma ligeramente basófilo y conserva la capacidad de síntesis de hemoglobina. Tras 2-4 días de maduración en la médula, pasa a sangre periférica por diapédesis y está en circulación 1-2 días. En condiciones normales su presencia debe ser cerca del 1% de los eritrocitos totales, pero en situaciones patológicas puede aumentar.
El eritrocito ya maduro tiene una semivida de 120 días en sangre periférica. Carece de núcleo, capacidad de síntesis de hemoglobina y de división. Tiene un tamaño de 7-8 µm y forma bicóncava (6).
En condiciones normales, la destrucción de los eritrocitos se produce principalmente en el espacio extravascular. Una vez el eritrocito ha estado circulando cerca de 120 días, las células del sistema mononuclear fagocítico las captan y trasladan al bazo, hígado o médula para proceder a su degradación. Hay productos de la destrucción que serán reciclados para volverlos a utilizar en la síntesis de nuevos eritrocitos. Es el caso del hierro, gracias a la transferrina que lo transporta hasta la médula o almacena en forma de ferritina. La globina también se reutiliza. En cambio, La protoporfirina derivada de la degradación del grupo hemo, pasará por el hígado para convertirse en bilirrubina.
En situaciones patológicas, la hemólisis que se produce es intravascular y como consecuencia se libera el contenido citoplasmático del hematíe en sangre. Se pueden encontrar concentraciones de enzimas intraeritrocitarias como lactato deshidrogenasa, aumentadas en el torrente sanguíneo (8).
El eritrocito es la célula más importante y abundante de la sangre. Tiene un tamaño entre 7-8 µm y forma de disco bicóncavo. Tiene 3 componentes principales: Membrana, hemoglobina y enzimas. Se caracteriza por tener un color rojizo debido a la hemoglobina que contiene. Carece de núcleo y orgánulos en su citoplasma, como consecuencia no puede dividirse ni sintetizar proteínas.
Figura 3. Eritrocito (3).
Su función principal es el transporte de oxígeno que capta la hemoglobina al pasar por los pulmones hacia los tejidos, formando el complejo oxihemoglobina. Una vez cede el oxígeno, lo intercambia por dióxido de carbono que se transforma en bicarbonato gracias a la anhidrasa carbónica o forma complejo con la hemoglobina como carbaminohemoglobina, transportando el CO2 de vuelta a los pulmones para su eliminación.
La actividad metabólica del hematíe es reducida debido a la ausencia de mitocondrias en su interior. Pero destaca el metabolismo para la transformación de glucosa a glucosa-6-fosfato, que le permite obtener energía y poder reductor mediante dos vías metabólicas:
La enzima principal que se encuentra en el citoplasma de los glóbulos rojos es lactato deshidrogenasa (LDH).
La sangre se compone de una fracción líquida denominada plasma que ocupa el 55% de su volumen total, y una fracción forme compuesta por eritrocitos, plaquetas y leucocitos que ocupan el 45% restante.
El plasma es un líquido transparente con tonalidad amarilla compuesta esencialmente por agua, pero también de sustancias relevantes como: Proteínas, lípidos, glúcidos, vitaminas, hormonas, enzimas, entre las que destacan moléculas fundamentales para la hemostasia como la fibrina, fibrinógeno y factores de coagulación. Cuando se elimina el fibrinógeno en plasma, pasa a ser suero.
Las células predominantes en la sangre son los glóbulos rojos, puesto que son el 99% de las células presentes en este líquido biológico, le siguen las plaquetas y los leucocitos. La gran presencia de eritrocitos determina su función principal, la respiratoria, con el transporte de oxígeno a los diferentes tejidos por las arterias y trasladar el dióxido de carbono a los pulmones, para que se produzca el intercambio gaseoso. También se encarga de la función defensiva, regulación hormonal, equilibrio ácido-base, el transporte de nutrientes, enzimas y metabolitos de desecho entre otros.
Las muestras que se suelen utilizar para los distintos estudios hematológicos que se realizan en el laboratorio proceden de punciones en capilares dactilares o de extracciones de sangre en venas braquiocefálicas, que se recogen en los tubos con EDTA (ácido etileno-diamina-tetra-acético). El EDTA ejerce un efecto quelante sobre el calcio evitando que se desencadene la cascada de coagulación, favoreciendo la conservación e integridad de la muestra para su posterior estudio.
Los métodos para determinar estos parámetros han avanzado bastante a nivel de laboratorio debido a la automatización, ayudando a que los tiempos de análisis se acorten y aumenten la cantidad de muestras que se analizan a la vez. Los autoanalizadores más modernos junto a los diferentes software informáticos que utilizan, son capaces de detectar anomalías o alteraciones en estos parámetros, comunicarlos y ampliar el estudio de ese perfil cuando los valores están fuera de los rangos determinados utilizando una serie de algoritmos establecidos.
El hemograma es un estudio básico en hematología presente en las analíticas de rutina, por ello es el más común en el laboratorio. Tiene como objetivo cuantificar los parámetros más relevantes de las células presentes en sangre periférica, los eritrocitos, las plaquetas y los leucocitos. Los valores son absolutos o en porcentajes. Con los resultados del hemograma se pueden detectar alteraciones que necesiten un estudio más exhaustivo, como ocurre cuando los valores de hematíes o de hemoglobina son bajos y se sospecha de una anemia. Este estudio está muy estandarizado en el laboratorio, por lo que en ciertos hospitales la validación de hemogramas cuyos valores estén dentro del rango establecido, es automática (8).
Los rangos de referencia para los valores del hemograma los debe establecer el laboratorio, teniendo en cuenta las características como el sexo y la edad de su población normal. En la siguiente tabla se encuentran los valores de referencia, aproximados, de un hemograma en adultos (Tabla 2):
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Hematíes |
Hombre: 4 - 6 × 1012 células/L Mujer: 3,9 - 5 × 1012 células/L |
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Hematocrito (HCT) |
Hombre: 43 - 50% Mujer: 35 - 43% |
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Hemoglobina |
Hombre: 13 - 17 g/dl Mujer: 12 - 16 g/dl |
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Glóbulos blancos |
3,4 – 9,6 × 1012 células/L |
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Plaquetas |
Hombre: 1,35 - 3,2 × 1012 células/L Mujer: 1,57 - 3,7× 1012 células/L |
Tabla 2. Valores de referencia en el hemograma (Elaboración propia).
Hematocrito (HCT)
Proporción, medida en porcentaje, de la cantidad de hematíes en el volumen de sangre total. Cuando está por debajo de sus valores de referencia se considera anemia y cuando es superior hay poliglobulia.
Volumen corpuscular medio (VCM)
El volumen promedio que ocupan los eritrocitos en sangre. Los valores normales son de 80-100 fL. Permite la clasificación, por tamaño, de las anemias:
Hemoglobina corpuscular media (HCM)
Determina la cantidad promedia de hemoglobina en cada eritrocito. Los valores normales están entre 28 y 32 picogramos.
Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM)
Informa de la concentración de hemoglobina en 100mL de glóbulos rojos. Los valores normales son 32-36%
Este parámetro da información para la clasificación de las anemias según la coloración:
Amplitud de distribución eritrocitaria (ADE)
Proporciona información sobre la homogeneidad en el tamaño de los eritrocitos. Parámetro importante en anemias para clasificarla como anisocítica, cuando se encuentran eritrocitos de diferente tamaño, o isocíticas si coinciden en tener un tamaño similar. Su valor de referencia debe ser ≤ 15%, si es superior se considera anisocitosis (9).
Recuento reticulocitario
Un parámetro útil para valorar la síntesis de eritrocitos por parte de la médula. Su valor normal está comprendido entre 25 y 85 x 103 cél/L. Con este recuento se clasifican las anemias en regenerativas o arregenerativas.
El frotis de sangre para realizar este recuento se tiñe con azul de metileno. Hay disponibilidad de contadores automatizados con mayor precisión para este estudio.
Reticulocitos corregidos con el hematocrito
Para evitar problemas de recuento que puedan sobrestimar los valores de reticulocitos. Por ejemplo, en casos de anemia puede aumentar y se debe establecer una diferencia entre las siguientes situaciones:
Sideremia o hierro plasmático
Cantidad de hierro sérico, los valores normales se encuentran dentro del rango 50-170 µg/dl. Se utiliza en el diagnóstico de anemias, aunque no de manera aislada. Disminuye en casos de anemia ferropénica y aumenta en enfermedades que afectan al metabolismo del hierro como la hemocromatosis.
La técnica empleada para su análisis es la espectrofotometría. La muestra de suero se pone en medio ácido, donde el hierro procede a disociarse del complejo que forma con la transferrina. El hierro libre en el medio ácido pasa a ión ferroso, que posteriormente se unirá con la sustancia cromogénica que se utilice y dará una señal proporcional a la cantidad de hierro presente en la muestra.
El resultado de la sideremia se estudia junta los parámetros relacionados con la transferrina como la capacidad total de fijación de hierro y el índice de saturación de esta glicoproteína. La relación de estos 3 valores es esencial para estudiar el tipo de ferropenia que tiene un paciente, estableciendo la diferencia entre la ferropenia producida por falta de absorción en la dieta y la pseudoferropenia que se produce por bloqueo en la disponibilidad del hierro almacenado.
Ferritina sérica
La ferritina es una molécula hidrosoluble que se une a la proteína apoferritina. Esta proteína es una de las formas más importantes de almacenamiento en el organismo, localizadas principalmente en el hígado, el bazo y la médula ósea. Puede encontrarse dentro o fuera de la célula guardando un equilibrio entre ambos compartimentos. En situaciones que aumentan la demanda de hierro, baja a nivel intracelular y aumenta en el espacio extracelular. La ferritina tiene la ventaja de poder detectarse en suero, a diferencia de la hemosiderina, y poder relacionarse directamente con la cantidad total de hierro almacenado en el cuerpo, para detectar casos de déficit o exceso.
Los métodos para cuantificar sus niveles en suero son inmunológicos, inmunoensayos con enzimas o radioinmunoensayos.
Proporciona información sobre los depósitos de hierro en general, aunque hay que tener en cuenta posibles interferencias analíticas. Su valor puede estar falsamente elevado, al ser una reactante de fase aguda, en infecciones o estados inflamatorios.
Su valor de referencia está entre 20-300 ng/mL en hombres y de 15-120 ng/mL en mujeres.
Transferrina
Es una glicoproteína de síntesis hepática que se encarga del transporte de hierro obtenido de la dieta, tras su absorción intestinal, y de hierro reciclado tras la destrucción de los eritrocitos maduros. Cada transferrina es capaz de transportar 2 átomos de hierro (Fe3+). Su destino principal es la médula ósea, pero también transporta hierro para la síntesis de enzimas. Cuando no está formando el complejo con los iones de hierro se denomina apotransferrina. En situaciones de sobrecarga cuando esta proteína está totalmente ocupada, pasa a ser transferrina saturada.
Su valor de referencia está entre 250-360 mg/dL
Su estudio es relevante para las anemias microcíticas. En anemias ferropénicas su valor es alto ya que intenta captar todo el hierro liberado de los depósitos para promover la eritropoyesis y síntesis de grupo hemo. Es bajo en talasemias y anemias por enfermedad crónica, puesto que existe un bloqueo de los depósitos de hierro que baja su disponibilidad a nivel sérico.
Índice de saturación de transferrina (IST)
Este índice mide el porcentaje de ocupación de hierro en la transferrina.
En anemias ferropénicas el porcentaje de saturación es bajo, a diferencia de situaciones de exceso de hierro en suero como sucede en anemias hemolíticas.
Su valor de referencia está entre 20 y 45%
Capacidad total de fijación del hierro (CTFH)
Mide la capacidad de captación de hierro de la transferrina. En condiciones normales, un tercio de los sitios de unión de hierro de la transferrina están ocupados por iones férricos. Cerca de la totalidad del hierro presente en el plasma está unido a la transferrina, por ello existe una correlación directa entre la cantidad de hierro en suero y esta glicoproteína. Para medir esta capacidad de fijación, se intenta saturar esta proteína al completo.
El método para medir la cantidad de hierro se basa en saturar la muestra de suero, eliminar el exceso y someterlo a un método colorimétrico para calcular la sideremia.
Su valor de referencia está entre 240-400 ng/mL.
Estos valores aumentan cuando hay déficit de hierro como en la anemia ferropénica, y son bajos cuando hay exceso de hierro en suero como en la hemocromatosis.
Receptor soluble de transferrina en suero
Estos receptores de transferrina transmembrana se encuentran en la mayoría de las células, principalmente en los eritroblastos y reticulocitos. En estas células cuando la transferrina saturada se une al receptor, se internaliza y cede los iones de hierro con el objetivo de proporcionar suministro suficiente para la síntesis de grupo hemo. Finalmente, la transferrina no saturada vuelve a ser liberada al plasma.
Ante un déficit de hierro, los eritroblastos sintetizan mayor número de receptores de este transportador para poder captar todo el hierro disponible en plasma (11).
Para cualquier estudio de muestras hematológicas en el laboratorio, con el fin de asegurar una buena calidad de los resultados, es importante el control de las distintas fases por las que pasará la muestra. La información proporcionada a lo largo de este proceso será relevante a la hora de informar sobre un posible diagnóstico.
En la fase preanalítica será importante el informe médico que explique el motivo de petición de análisis, cómo se obtiene la muestra y las condiciones en las que se transporta.
En la fase analítica se tendrán en cuentan las técnicas utilizadas para obtener la información solicitada; adecuar los resultados a las características del paciente, por ejemplo, ajustar los rangos de los valores de referencia al sexo, la edad y raza;
Por último, en la fase posanalítica, informar del resultado y si es necesario la realización de pruebas complementarias para el diagnóstico completo.
Esta técnica es esencial para el estudio morfológico de las células sanguíneas, está recomendada cuando los autoanalizadores detectan alguna alteración o ante la sospecha de una patología en concreto, proporcionando un diagnóstico diferencial.
En el frotis se debe colocar una gota de sangre sobre el portaobjetos y proceder a su extensión con la ayuda de otro portaobjetos. 1) Depositar una gota de sangre sobre el portaobjetos, con la ayuda de un tubo tipo capilar. 2) Colocar el extremo del porta extensor a la izquierda de la gota y acercarlo la muestra de sangre con una inclinación de 45º. Dejar que se extienda la sangre por el borde. 3) Deslizar el portaobjetos hacia la izquierda y extender la gota. Finalmente se deja secar para su posterior tinción. Debe ocupar el 75% del portaobjetos donde se realice.
Al preparar una extensión sanguínea, se aprecian 3 zonas:
Figura 4. Partes de un frotis sanguíneo (Elaboración propia).
La preparación debe ser uniforme, una extensión densa puede dar lugar a errores de análisis por aglomeración o apilamiento de las distintas células sanguíneas y en caso de ser muy fina, dificulta el conteo y visualización correcta de estos elementos.
Actualmente hay dispositivos automatizados que realizan una preparación completa de extensión-tinción, facilitando un mayor número de frotis sanguíneos con distribución homogénea en menos tiempo.
Una vez preparada la muestra, las tinciones más utilizadas para el estudio de estos elementos son la siguientes:
May Grünwald-Giemsa
Es una técnica de tinción tipo Romanowsky utilizada en hematología para observar y diferenciar los distintos tipos de células sanguíneas en una muestra de sangre periférica. Se utiliza para la identificación y clasificación de estas células, para poder estudiar alteraciones en forma, tamaño, cantidad y detectar posibles inclusiones en su interior.
Es una combinación de 3 tintes diferentes: Un colorante ácido, el azul de metileno; un colorante básico, eosina; un colorante selectivo de la cromatina que es azur II. Con esta técnica, los glóbulos rojos se tiñen con un tono rosado, los blancos se tiñen de azul y los demás elementos del citoplasma en rosa, violeta y azul, consiguiendo la coloración de todos elementos. Los pasos, de la técnica a seguir, son:
Posteriormente se prepara el portaobjetos con aceite de inmersión y el objetivo X10 para evaluar la calidad del frotis y realizar un visionado general para detectar aglomeraciones, fragmentos o distribuciones anómalas que puedan estar causadas por una mala preparación de la muestra a analizar. Finalmente, para realizar un estudio morfológico de las células sanguíneas, se cambia al objetivo X100 del microscopio.
Su uso es fundamental en el diagnóstico y seguimiento de trastornos sanguíneos. También se utiliza para detección de parásitos en sangre.
Tinción de Wright
Es una técnica rápida y fácil de realizar, ampliamente utilizada en hematología para la identificación y clasificación de células sanguíneas. Es una combinación de dos tintes diferentes, eosina y azul de metileno.
Los glóbulos rojos se tiñen de rosa, los núcleos de los glóbulos blancos azul y los núcleos y diferentes citoplasmas de rosa, violeta o azul.
El último paso es la observación microscópica: La muestra tintada se observa al microscopio con la lente de inmersión de aceite para observar la muestra con mayor resolución, tal y como se especifica en la técnica de tinción anterior (12).
Tinción de Perls
Es la reacción con azul de Prusia que se utiliza para detectar y estudiar los depósitos de hierro o hemosiderina en las células presentes en la biopsia de médula ósea.
Los eritroblastos pueden presentar hasta 4 gránulos de hemosiderina en su citoplasma, con esta tinción adquieren una tonalidad azul-verdosa y se denominan sideroblasto. En casos de anemia hay situaciones en las que el estudio de estos depósitos es esencial para el diagnóstico diferencial. Los depósitos de hierro en macrófagos también se pueden teñir (13).
Figura 5. Muestra hematológica con tinción de Perls (14).
Estas técnicas tienen el objetivo de cuantificar la cantidad de eritrocitos presentes en un volumen determinado.
Recuento manual por microscopía: La técnica más tradicional es el recuento de hematíes en la cámara de Neubauer o hemacitómetro. Se utiliza para el recuento de hematíes maduros e inmaduros presentes en una muestra de sangre.
Contadores automáticos: Los contadores automáticos de eritrocitos son dispositivos utilizados en el laboratorio para cuantificar y clasificar células sanguíneas de manera rápida y precisa. Estos dispositivos funcionan mediante la utilización de tecnología óptica y electrónica para analizar las características de las células sanguíneas.
Existen varios tipos de contadores automáticos de eritrocitos, dentro de los más comunes se encuentran (15):
Prueba de Coombs o antiglobulina
Técnica inmunológica para detectar anticuerpos presentes en sangre que pueden unirse a los eritrocitos y producir su hemólisis. Hay dos modalidades, test de Coombs directo que se realiza sobre la muestra de sangre o la modalidad indirecta que se utiliza con muestras de suero. Se utiliza para el diagnóstico diferencial de las anemias hemolíticas, determinando si la hemólisis es debida a la presencia de anticuerpos o por otras condiciones extra/intracorpusculares.
Prueba autohemólisis
Este método se utiliza para detectar alteraciones en la membrana o problemas metabólicos del eritrocito. Los hematíes se incuban a la temperatura corporal durante dos días y se estudia el tiempo que tarda en producirse la hemólisis, ya que, si disminuye hay sospecha de alguna anomalía. Útil en diagnóstico de anemias por déficit de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa o esferocitosis.
Prueba de fragilidad osmótica
Esta prueba tiene el objetivo de medir la resistencia osmótica eritrocitaria (ROE) cuando se somete una muestra de sangre a soluciones de NaCl en orden decreciente de concentración. En un ambiente cada vez más hipoosmolar, el glóbulo rojo introduce agua en su citoplasma aumentando su tamaño proporcionalmente. En condiciones normales puede llegar a aumentar en un 70% su volumen sin producirse la lisis. Esta técnica mide a qué concentración se lisan el 50% de los eritrocitos, para detectar posibles alteraciones en la membrana de los hematíes que lo hagan susceptible a hemólisis.
Una vez se produce la lisis y se libera hemoglobina al medio, esa concentración de hemoglobina es la que se mide por espectrofotometría. Si la lectura visual, detectar en qué tubo y a qué concentración de NaCl se produce la hemólisis: Un tubo con coágulo en el fondo y sobrenadante claro es negativo en hemólisis, pero si el sobrenadante cambia a un tono rojizo ya se está produciendo la hemólisis. Útil en el diagnóstico de esferocitosis, estomatocitosis y talasemias.
Concentración de haptoglobina
La haptoglobina es una proteína de síntesis hepática encargada de transportar la hemoglobina liberada tras la hemólisis al hígado para que se proceda a su degradación. Cuando el resultado está por debajo de lo normal, indica una posible anemia hemolítica. En estados inflamatorios sus niveles aumentan, es un reactante de fase aguda positivo.
Su rango de concentración normal puede estar entre 40 y 160 mg/dL.
El examen morfológico de las células sanguíneas es la base de cualquier estudio hematológico. Detectar anomalías en los elementos formes de la sangre son pasos claves para el diagnóstico de múltiples enfermedades hematológicas como, por ejemplo, la anemia. El frotis de sangre es la técnica más usada para detectar alteraciones de forma o tamaño al microscopio. La muestra se obtiene con una gota de sangre capilar tras la punción en un dedo o de una muestra venosa extraída con un tubo de EDTA (16).
Alteraciones en el tamaño de los eritrocitos
Anisocitosis
En una extensión normal, se observan tamaños y diámetros diferentes.
Microcitosis
El tamaño del eritrocito es < 6µm, por lo que el VCM se ve disminuido< 75 fL. Característico en las anemias ferropénicas y en talasemias.
Macrocitosis
El tamaño del eritrocito está aumentado, 8-11µm, el VCM aumenta >100 fL. Característico de anemias por déficit de Vit B12 o megaloblástica, aplásicas y en hepatopatías crónicas.
Alteraciones en la forma de los eritrocitos
Cuando se observa la morfología de los eritrocitos con el microscopio, ya sea uno convencional o electrónico de barrido, se pueden encontrar las siguientes anomalías en cuanto a su forma:
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DIANOCITOS (Forma de diana) |
Una superficie más grande y son finos. La zona más externa es oscura, la zona intermedia es pálida y se aprecia mayor concentración de hemoglobina justo en el centro, de ahí su apariencia de diana. Alteración en la distribución de colesterol y lípidos. |
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ACANTOCITOS |
Eritrocitos con espículas finas distribuidas de forma irregular en su membrana, debido a una afectación en los lípidos de membrana. |
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EQUINOCITOS |
Eritrocitos con espículas gruesas en su membrana, distribuidas de forma regular, con forma esférica. |
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ESFEROCITOS
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Eritrocitos sin zona de palidez central, de menor diámetro y con forma esférica. |
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ELIPTOCITOS |
Eritrocitos con forma alargada, redondeados y simétricos |
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DACRIOCITOS |
Eritrocitos con forma de lágrima.
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ESTOMATOCITOS |
Eritrocitos en forma de bolsa, se observa una depresión acusada en la zona central. |
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ESQUISTOCITOS |
Eritrocitos fragmentados con forma de casco y de tamaño pequeño< 6µm.
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DREPANOCITOSIS
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Eritrocito con forma semilunar, alargado y estrecho. Mala polimerización de HbS. |
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Tabla 3. Anomalías estructurales más comunes (Elaboración propia).
Figura 6. Alteraciones morfológicas en la membrana de los eritrocitos (3).
Alteraciones en la coloración y/o inclusiones eritrocitarias
La disminución o aumento en la coloración de los eritrocitos se puede estudiar gracias a la tinción de May Grünwald-Giemsa de estas células. Depende de la concentración de hemoglobina en el hematíe, este fenómeno se denomina cromasia y puede dar lugar a las siguientes alteraciones (17):
Hipocromía
La concentración de hemoglobina se ve disminuida, tanto la zona central como la exterior, se vuelven más pálidas. Característico de las anemias ferropénicas y las talasemias.
Hipercromía
Se produce un exceso de coloración por el aumento en la concentración de hemoglobina del eritrocito. Característico de la esferocitosis.
Las inclusiones intraeritrocitarias, son elementos inusuales que se detectan en el eritrocito maduro, gracias a las técnicas de tinción y su posterior observación al microscopio. Se deben estudiar detenidamente, para diferenciar las inclusiones intraeritrocitarias comunes de las producidas por presencia de parásitos en su citoplasma, como ocurre en infectados por la malaria. Las más comunes son:
Cuerpos de Pappenheimer
El glóbulo rojo presenta múltiples gránulos de hemosiderina en las zonas más exteriores de su citoplasma. Estas inclusiones se tiñen de violeta intenso tras la tinción de May Grünwald-Giemsa. Esta célula recibe el nombre de siderocito, y son características en el estudio hematológico de anemias sideroblásticas, hemolíticas, aplásicas y en situaciones de exceso de hierro almacenado.
Figura 7. Muestra de eritrocitos con cuerpos de Pappenheimer (14).
Cuerpos de Heinz
Inclusiones localizadas en el margen de la pared del eritrocito que aparecen en casos de anemia por déficit de glucosa-6 fosfato-deshidrogenasa.
Figura 8. Muestra de eritrocitos con cuerpos de Heinz y reticulocitos (14).
Cuerpos de Howell Jolly
El eritrocito presenta inclusiones de tipo puntiforme y violetas, de tamaño medio, en la zona periférica de su citoplasma, están formados por restos del núcleo del eritroblasto que no han sido degradados y eliminados de forma correcta. Aparecen en pacientes con esplenectomía, puesto que dentro de las múltiples funciones que tiene el bazo, se encuentra el eliminar las inclusiones eritrocitarias de este tipo.
Figura 9. Muestra de eritrocitos con cuerpos de Howell Jolly (14).
Punteado basófilo
Este tipo de inclusión se produce como consecuencia de múltiples aglomeraciones de material ribosómico dentro del citoplasma, debido a un exceso de ácido ribonucleico. Aparecen en muestras de pacientes con una intoxicación por plomo y en ciertos casos de talasemia.
